Universidade estadual do norte fluminense darcy ribeiro




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ORIGEM E QUALIDADE DA MATÉRIA ORGÂNICA: INFLUÊNCIA SOBRE A RIQUEZA BACTERIANA NO SEDIMENTO DO MANGUEZAL DE RIO DAS OSTRAS/RJ

ALBANY AGUES MARCHETTI LUGÃO

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
Campos dos Goytacazes
Janeiro/2013
ORIGEM E QUALIDADE DA MATÉRIA ORGÂNICA: INFLUÊNCIA SOBRE A RIQUEZA BACTERIANA NO SEDIMENTO DO MANGUEZAL DE RIO DAS OSTRAS/RJ
ALBANY AGUES MARCHETTI LUGÃO

Dissertação apresentada ao Programa de Ecologia e Recursos Naturais da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ecologia e Recursos Naturais.




Orientador: Prof. Dr. Carlos Eduardo de Rezende
Co-orientadora: DSc. Adriana Daudt Grativol


Campos dos Goytacazes, RJ

Janeiro/2013

ORIGEM E QUALIDADE DA MATÉRIA ORGÂNICA: INFLUÊNCIA SOBRE A RIQUEZA BACTERIANA NO SEDIMENTO DO MANGUEZAL DE RIO DAS OSTRAS/RJ


ALBANY AGUES MARCHETTI LUGÃO
Dissertação apresentada ao Programa de Ecologia e Recursos Naturais da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ecologia e Recursos e Naturais.

Aprovada em 25 de janeiro de 2013.

Comissão Examinadora:
_______________________________________________________________

Dr. Marcelo Gomes de Almeida - UENF

_______________________________________________________________

Profa. DSc. Marina Satika Suzuki - UENF

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DSc. Lígia Macabu Ribas – Analista Ambiental – Vereda Estudos e Execução de Projetos Ltda.

_______________________________________________________________

Prof. DSc. Carlos Eduardo de Rezende (Orientador) - UENF

_______________________________________________________________

Prof.ª DSc. Adriana Daudt Grativol (Co-orientadora) – UENF

Dedico este trabalho à meus pais, Eleuza Agues e Altamiro Marchetti, que me ensinaram que eu poderia alcançar tudo que eu desejasse a partir do meu esforço e dedicação, e sobre tudo, amando o que estivesse almejando.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pela vida e pelo cuidado. “Até aqui me ajudou o Senhor”...

Ao meu orientador, DSc. Carlos Eduardo de Rezende que acreditou em mim, por me inspirar profissionalmente, e possibilitar a oportunidade de novos conhecimentos. Obrigada professor, pelo carinho e atenção. O senhor é para mim uma inspiração.

A minha co-orientadora, DSc. Adriana Grativol, pelo auxílio no desenvolvimento desse trabalho e amizade.

A UENF, ao PPGERN e ao LCA pela estrutura oferecida.

A CAPES, pela concessão da bolsa de estudos.

Ao INCT-TMCOcean e ao PNPD pelo suporte financeiro que proporcionou a execução deste projeto.

Aos professores do PPGERN, pelo conhecimento transmitido durante todo curso.

Ao DSc. Carlos Gatts, pela ajuda nas análises estatísticas e pelas conversas produtivas.

Ao DSc. Fabiano Thompson, do Departamento de Genética – UFRJ, por disponibilizar o uso do sequenciador em seu laboratório para as análises de TRFLP.

À técnica da UFRJ Milene Dias, pelo auxílio e dedicação nas análises.

Ao laboratório de Geoquímica da UFF pela análise de lipídeos.

À técnica do laboratório de Geoquímica da UFF, Thaís, pela realização da análise de lipídeos.

Ao Prof. Marcelo Bernardes pelo auxílio na interpretação dos dados de lipídeos.

Ao Prof. Fabio Olivares e Luciano Canellas pelas instruções em algumas análises.

A todo corpo técnico, Cristiano Peixoto, Edilma Muniz, Elisabete, Gerusa Monteiro, Arizoli Gobo, Ana Paula, Alcemir, Sr. Antônio, Ivanilton, Gérson, Elmo, por me ajudarem durante as análises e coletas de amostras.

Ao técnico Marcelo Almeida por me auxiliar nas análises, pelas conversas produtivas, pela paciência e pela revisão desse trabalho. Obrigada Marcelo!

Ao DSc. Álvaro Ramon Coelho Ovalle, pelas contribuições feitas durante a revisão desse trabalho.

Aos membros da banca Maria Cristina (Cristal), Marina Suzuki e Lígia Ribas por aceitarem o convite de avaliar esse trabalho.

Aos meus pais que acreditaram em mim há 10 anos quando saí de casa para estudar longe e morar sozinha, me apoiaram, vibraram com minhas conquistas, souberam abdicar de datas importantes ao meu lado, e com o coração apertado de saudades sempre me incentivaram. Vocês são pilar de sustento na minha vida.

À minha amiga, irmã e colega de campo, Marianna Louro, por sempre ter uma palavra de força, carinho, e um apelido divertido para me alegrar. Amiga, você foi fundamental para que esse trabalho se concluísse. Louvo a Deus pela sua vida e por sua amizade. MUITO OBRIGADA!

Às minhas amigas Rita Wetler, Andreia Magro, Aline Silva, Késsia Lima, Eliliane Vasconcelos, Celeste Cortes e Anna Mandarino pelos momentos de oração e descontração. Meninas vocês são presente de Deus na minha vida.

À minha amiga de república Marcelita França Marques, por aturar minhas crises pré-dissertação e pela ajuda na formatação do manuscrito. Obrigada Marcê pelo carinho.

À minha amiga, “hermana mayor” DSc. Sharon Cantrell, por em todo tempo acreditar em mim, pelo carinho nos momentos difíceis, mesmo estando distante e pelo auxílio na interpretação dos dados. Sua amizade é um presente de Deus para mim.

Aos meus pastores Luciano Ferreira Machado e Cristiane Machado, Obrigada pela amizade e confiança que vocês depositaram em mim todos esses anos.

Aos amigos paduanos, Marcela Nogueira, Ulisses Oliveira, Willian Pires, Gleyson Velasco, Danilo Ferreira, Thaynara Celino, Verônica Quirino, Juliana Sanches, Verônica Muniz pelos fins de semana descontraídos, pelas orações e palavras via telefone. Vocês me ensinaram o verdadeiro sentido da palavra suporte.

Aos meus amigos de laboratório Bruna Guedes, Juliana Sobreira e Phellipe Motta, pelas conversas divertidas na sala do café e palavras de apoio.

Aos colegas do grupo de biogeoquímica do LCA, Thiago Rangel (Tigrão), Jomar Marques, Frederico Brito, Beatriz Araújo, Cynara Fragoso, Bráulio Cherene, Marcos Franco, Lígia Ribas, Bianca Torres, Roger Carvalho, Emilane Lima, Ana Paula Barreto, Adailes Florence, Iris Heringer e Layra Passareli. Muito obrigada por me aturarem, pela ajuda na interpretação das análises (Tigrão, Jomar e Bia), pelas palavras de apoio e pelos altos papos de motivação pela ciclovia (Layra). Vocês são show!!!

Ao meu irmão Diego Marchetti e minha cunhada Carolina Lisboa por me apoiarem nos momentos difíceis e investirem em mim. Vocês são jóias raras.

Aos meus sobrinhos, Kauã, Arthur, Vicente e Liz por trazerem a meus fins de semana um brilho muito especial com seus sorrisos. Vocês fazem minhas conquistas serem mais brilhantes e motivantes.

Às amigas, Rozilene Rocha, Marília Arenai, Kátia Brum, Fabiana Alves, Márcia Andrade, Lucilma Batalha, Neymar Salgado, Jéssica Tardin e Elaine Lino pela compreenção, força e carinho.

Aos meus amigos Elaine Lugão e João Paulo Fonseca, que me ajudaram, apoiaram e entederam minha falta de tempo nesses últimos meses. Não tenho palavras para agradecer!

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho.

SUMÁRIO


1. INTRODUÇÃO 1

1.1. O Manguezal 1

1.3. Marcadores Moleculares 3

1.4. Assinatura Molecular e TRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) 6

2. OBJETIVOS 10

2.1. Objetivo Geral 10

2.2. Objetivos Específicos 10

3. HIPÓTESES 10

4.1. Área de Estudo e Coleta de Amostras 11

4.2. Análises Físico-Químicas do Sedimento 15

4.3 - Análise Molecular de TRFLP 19

4.4. Análises Estatísticas 23

5. RESULTADOS 24

5.1. Caracterização Fisico-Químicas dos Sedimentos e Razão Atômica entre Carbono e Nitrogênio (C/N)a 24

5.2. Caracterização Molecular 27

5.3. Análises de Esteróis 31

6. DISCUSSÃO 38

6.1. Influências dos Fatores Físico-Químicos Sobre a Comunidade Bacteriana 38

6.2. Origem e Transformação da Matéria Orgânica, Despejo de Efluentes e Sua Relação Com o Perfil da Comunidade Bacteriana 42

6.3. Avaliação dos dados por Análise de Componentes Principais (ACP) 49




LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Eletroferogramas de TRFLP. Eixo X apresenta o tamanho dos fragmentos, indicando a riqueza da amostra. Eixo Y apresenta a quantidade de fluorescência absorvida, inferindo a abundância dos filotipos................................................................9

Figura 2: Mapa de localização do ecossistema estudado e dos pontos de coletas............................................................................................................................12

Figura 3: Foto de eletroforese de PCR com o primer 16S de 3 dos pontos do manguezal de Rio das Ostras em gel de agarose 2% a 100V.......................................21

Figura 4: Molelo esquemático da análise de TRFLP.....................................................23

Figura 5: Gráfico de riqueza de filotipos encontrados nos 10 pontos com a enzima de restrição HaeIII para o gene 16S ribossomal.................................................................28

Figura 6: Gráfico de riqueza de filotipos encontrados nos 10 pontos com a enzima de restrição RsaI para o gene DsrAB..................................................................................28

Figura 7: Análise Similaridade (índice de Bray-Curtis) realizada com a tabela binária de riqueza gerada com a enzima de restrição HaeIII para o gene 16S ribossomal realizado pelo programa Past........................................................................................................29

Figura 8: Análise Similaridade (índice de Bray-Curtis) realizada com a tabela binária de riqueza gerada pela enzima de restrição RsaI para o gene DsrAB realizado pelo programa Past................................................................................................................30

Figura 9: Valores de coprostanol Normalizado pelo Carbono Orgânico (µg de coprostanol/100mg COrg)..............................................................................................31

Figura 10: Porcentagem de esteróis encontrados no sedimento em cada ponto..............................................................................................................................33

Figura 11: Análise de Componentes Principais entre a abundância relativa de cada filotipo presente nos pontos e as variáveis físico químcas.............................................36

LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Esteróis utilizados no presente estudo............................................................4

Tabela 2: Descrição dos pontos de coleta no rio das Ostras.........................................14

Tabela 3: Enzimas de restrição com sua sequência de reconhecimento (corte) e o seu organismo de origem......................................................................................................21

Tabela 4: Dados físico-químicos dos pontos de coleta no rio das Ostras.............26 Tabela 5: Riqueza de filotipos (TRFs) para cada enzima de restricão utilizada...........................................................................................................................27

Tabela 6: Concentração de esteróis nos sedimentos do Manguezal de Rio das Ostras.............................................................................................................................32

Tabela 7: Valores das razões indicativas do grau de transformação da matéria orgânica e da razão indicativa das fontes predominantes de matéria orgânica nos sedimentos.....................................................................................................................34

Tabela 8: Concentração de Coprostanol em diversas regiões......................................45

Tabela 9: Critérios e parâmetros de avaliação da contaminação por esgoto utilizando esteróis como indicadores de matéria orgânica de origem fecal....................................47

LISTA DE ABREVIAÇÕES
(C/N)a – Razão Carbono/Nitrogênio atônico.

ACP – Análise de Componentes Principais

Camp - Campesterol

Cop – Coprostanol

COR – Carbono Orgânico Reativo

COrg – Carbono Orgânico

CT – Carbono Total

DsrAB – Gene dissimilatory sulfite reductase

Estig – Estigmasterol

MO – Matéria Orgânica

MOS- Matéria Orgânica do Sedimento

NT – Nitrogênio Total

pH – Potencial Hidrogeniônico

PR – Fósforo Orgânico

Sal – Salinidade

TRFLP – Terminal Restriction Fragmentos Length Polimorphisms




RESUMO
O manguezal de Rio das Ostras, RJ, Brasil, é um ecossistema que vem sendo impactado com despejos de esgotos domésticos. As possíveis fontes de matéria orgânica e sua influência sobre a comunidade bacteriana no sedimento foram analisadas nesse estudo. Os biomarcadores moleculares foram utilizados como ferramentas analíticas para se caracterizar a fonte de matéria orgânica no local, assim como verificar os processos de biogênese. Para caracterizar o perfil bacteriano foi utilizada a análise de TRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polimorphysms) como ferramenta para inferir a riqueza, e comparar o perfil da composição em comparação. As concentrações de carbono orgânico variaram de 18,7 a 95,2 mg.g-1. A contribuição de matéria orgânica proveniente de plantas vasculares atingiu cerca de 30%, ou seja, maior que qualquer outra fonte em todos os pontos, indicando predominância de fontes terrígenas. A contaminação fecal foi verificada pro meio de naálise do coprostanol, que variou entre 1,22 – 12,52 µg/100mgCOrg, esterol esse que caracteriza contaminação fecal. As razões entre esteróis indicaram um nível elevado de contaminação. A razão colestanol/colesterol foi maior do que 1(um) para todos os pontos, indicando biotransformação nesses sedimentos. Para o perfil da comunidade bacteriana, todos os pontos apresentaram distinção, com alta riqueza de filotipos para o gene 16S RNA, mas com similaridade em torno de 50%. Quando observados os perfis gerados com o gene dsrAB, notou-se uma similaridade menor que 40% entre os pontos, e uma menor riqueza em relação ao gene 16S. Neste estudo, não foi observado um padrão de riqueza bacteriana relacionada aos padrões físico químicos isoladamente, mas sim as concentrações dos esteróis em associação com os fatores físico-químicos. No que concerne a origem e concentração das fontes de matéria orgânica, as análises realizadas apontam que embora haja uma grande contribuição de matéria orgânica característica de plantas vasculares, as concentrações de coprostanol indicam que esse manguezal encontra-se contaminado por esgoto, e que essa contaminação está sendo remediada pela biotransformação realizada pelas bactérias.

Palavras Chaves: Manguezal, Bactérias, TRFLP, Biomarcadores, Esgoto.
ABSTRACT
Rio das Ostras Mangrove, RJ, Brazil, is an ecosystem that is being impacted with domestic sewage dumps. Possible sources of organic matter and its influence on the bacterial community in the sediment were analyzed in this study. The molecular biomarkers were used as analytical tools to characterize the source of organic matter on site, as well as verify the processes of biogenesis. The TRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polimorphysms) was used for characterize the bacterial profile as a tool to infer the bacterian composition profile. The organic carbon concentrations ranged from 18.7 to 95.2 mg/g. The contribution of organic matter from vascular plants reached about 30%, greater than any other source at all points, indicating predominance of terrigenous sources. The analysis showed lipid values ​​coprostanol between 1.22 to 12.52 μg/100mgCOrg, featuring this sterol fecal contamination. The ratios sterols indicated a high level of contamination. The reason cholestanol/cholesterol was higher than 1 (one) for all points, indicating biotransformation these sediments. To profile the bacterial community all points presented distinction, with high diversity of phylotypes for the 16S RNA, but with similarity around 50%. When observed profiles generated with the gene dsrAB, noticed a similarity less than 40% between points, and less diversity relative to 16S. In this study we did not observe a pattern of bacterial diversity patterns related to physical chemical isolation, but the concentrations of sterols in combination with physico-chemical factors. As regards the source and concentration of sources of organic matter, the analyzes show that while there is a great imput of organic matter characteristic of vascular plants, the coprostanol concentrations indicate that this mangrove is contaminated by sewage, and that this contamination is being remedied by biotransformation carried by the bacteria.
Key Words: Mangrove, Bacteria, TRFLP, Biomarkers, Sewage.

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