Manual de Aulas Práticas de Microbiologia




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Centro Universitário Franciscano - UNIFRA

Área da Saúde

Curso de Farmácia





Manual de Aulas Práticas de Microbiologia

Elaborado por: Taíse Biscaglia Vieira

Wilson Junior Maxwell Roquete

Supervisão: Profº Roberto Christ Vianna Santos


Santa Maria, agosto de 2005



P r e f á c i o

A relação ensino-aprendizagem envolve grandes e complexas decisões, devendo contar sempre com o envolvimento de professores e alunos.

Com a iniciativa de um pequeno, mas muito interessado grupos de alunos do sexto semestre do curso de Farmácia do Centro Universitário Franciscano – UNIFRA, elaboramos este simples projeto. Como resultado de alguns questionamentos, concordamos em revisar e ampliar o programa de ensino de aulas práticas, aperfeiçoando-o e colocando uma maior interatividade e consequentemente um maior envolvimento do acadêmico.

Este manual representa um primeiro passo de nossos objetivos, constituindo um agente facilitador e uma importante ferramenta na aprendizagem em Microbiologia. Aos acadêmicos Taíse Biscaglia Vieira e Wilson Júnior Maxwell Roquete, apresento meus cumprimentos e agradecimentos.


Santa Maria, agosto de 2005



Professor Roberto Christ Vianna Santos

Professor de Microbiologia

Centro Universitário Franciscano

P R Á T I C A 1 – B i o s e g u r a n ç a
O estudante deverá estar na sala de aula prática, obrigatoriamente:


  • usando avental;

  • cabelos presos;

  • sapato baixo e fechado;

  • calça comprida;

  • não usar brinco e assemelhados;

  • sempre com luvas;

Cuidados que se devem tomar para evitar a contaminação nas aulas práticas:



  • A bancada de trabalho deve estar a mais desimpedida possível, evitar cadernos, bolsas e apontamentos que não serão utilizados durante a fase experimental, evitando acidentes e deixando o local livre para o manuseio do material em estudo.

Em todos os trabalhos práticos, observar os seguintes critérios:



  • Fazer limpeza da bancada com álcool 70%.

  • Bico de Bunsen com chama azulada, a utilização deste, visa flambar a alça ou agulha bacteriológica e propiciar um ambiente asséptico ao redor do material que você manuseia. Deve-se trabalhar com a chama a sua frente para evitar acidentes com fogo, e esse fato indesejado só depende de seu “cuidado”.

  • Alça ou agulha bacteriológica deve ser flambada até o rubor, antes e após cada experimento, elas são flambadas para evitar resultados indesejáveis ao seu estudo, pois microrganismos podem estar assentados sobre o material. A flambagem é obrigatória, pois, esse material posteriormente poderá contaminar outras pessoas como colegas, professores e o material de limpeza.

  • Sempre que utilizar pipetas, lâminas e outros materiais que não podem ser esterilizados por calor seco (flambagem), solicitem ao professor ou monitor presente, a orientação quanto ao local adequado onde você deverá desprezá-los. Nunca abandone esse material sobre a bancada, lixo etc, para evitar contaminação de pessoas desavisadas que não devem pagar pelo seu descuido.




  • Sempre que houver algum acidente como quebra de tubos ou placas com microrganismos, contato com material contaminado etc, não se desespere, pois saiba que o objetivo de seu professor ou monitor é prepará-los adequadamente para seus futuros compromissos profissionais, e não de submetê-los a riscos de infecção. Esses microrganismos têm baixo poder patogênico, e você deve sempre avisar seu professor ou monitor para que ele tome providências adequadas e imediatas.

  • Ao final de todo trabalho prático, retirar as luvas de forma adequada, lavar as mãos com água e sabão e posteriormente álcool 70% ou iodado.

  • Todas as vezes que você utilizar o microscópio, você deve ao final do trabalho, limpar as objetivas e mantê-los livre do alcance de pó. Foi através da manutenção adequada destes instrumentos caros, por colegas que lhe antecederam, que permitiu que você hoje as utilizasse. Não quebre esta cadeia.


P r o c e d i m e n t o s: t é c n i c a s g e r a i s


  1. Flambagem da alça ou agulha bacteriológica: colocar o instrumento sobre a chama, numa inclinação aproximada de 45º e nunca em posição horizontal para não esterilizar só a porção final e sim toda a alça.

  2. Abrir o tubo de cultura: para os destros: sugere o tubo com a mão esquerda e retire o tampão com os dedos mínimo e anelar da mão direita, deixando livres os dedos médios, indicador e polegar para manuseio da alça bacteriológica e da pipeta, evitando assim deixar o lampião sobre a bancada o que livraria a sua contaminação.

  3. Abrir a placa de petri: coloque a placa fechada sobre a bancada, com a tampa para baixo. Retire o fundo da placa com a mão esquerda e assim você terá a mão direita livre para semear microorganismos na superfície do meio de cultura.

  4. Semeadura por esgotamento: semeie o material contido numa alça ou “Swab” num dos quadrantes da placa com movimentos de vai e vem. Gire a placa 90º e repita esses movimentos atingindo apenas um dos quadrantes. Gire novamente a placa, e repita o procedimento anterior. No 4º quadrante da placa faça um zigue-zague largo. Com isso você obterá colônias isoladas.

  5. Semeadura em profundidade, em tubos: semeie o material contido em uma agulha fazendo picadas até o fundo do tubo, com isso haverá o crescimento de microorganismos anaerobiose.




  1. Confecção de um bom esfregaço: Desengordure a lâmina passando-a livremente pela chama e limpando-a com um papel absorvente. Coloque no centro da lâmina o material a ser corado evitando a concentração excessiva num único local, mas proporcionando a obtenção de um esfregaço denso. Em seguida passe pela chama a parte oposta da lâmina, para fixar o esfregaço que estará pronto quando todo o material estiver seco. Não esqueça de identificar o lado da lâmina onde fez o esfregaço. Em seguida realize a coloração desejada.


P R Á T I C A 2 - C o l o r a ç õ e s
2.1) Coloração de Gram

A) Material necessário:

- Lâmina para microscopia;

- lápis para vidro;

- alça de platina;

- tubo contendo solução salina esterilizada;

- cultura de bactérias gram positiva e negativa;

- bateria de coloração de Gram (cristal violeta, lugol, álcool acetona, fucsina fenicada);

- microscópio, óleo de imersão, papel absorvente;

- suporte para lâminas;

- secador de cabelo.

B) Procedimento:

b.1) Esfregaço:

- flambar rapidamente uma lâmina de microscopia limpa, nos dois lados, “cortando” lentamente a chama do bico de Bunsen;

- identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço;

- flambar a alça de platina até o rubor, e a seguir, deixá-la esfriar, conservando-a toda via perto da chama;

- tomar o tubo de cultura com a mão esquerda e com os dedos mínimo e anelar da mão direita remover o lampião da boca do tubo;

- flambar a boca do tubo de cultura;

- introduzir a alça de platina, apreendida entre o polegar e o indicador da mão direita, no interior do tubo até tocar o meio de cultura – retirar a alça;

- flambar novamente a boca do tubo de cultura;

- fechar o tubo com o tampão e colocá-lo na estante;

- tomar uma lâmina (anteriormente preparada) com a mão esquerda e depositar no centro da mesma a gotícula de suspensão bacteriana;

- espalhar o material com movimentos de rotação da alça de platina, para se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme, secar naturalmente;

- esfregaço nas proximidades da chama ou utilizar o secador de cabelo para auxiliar na secagem.


b.2) Fixação:

- fixar o esfregaço, “cortando” lentamente a chama por 3 vezes, a fim de que o material fique bem aderente à lâmina. A fixação é sempre feita do lado contrário ao esfregaço bacteriano.

b.3) Técnica:

- fazer um esfregaço homogêneo e fixar pelo calor e esperar esfriar;

- cobrir com cristal violeta e deixar agir por 1 minuto;

- cobrir com solução de lugol por 1 minuto;

- lavar com água;

- descorar rapidamente com álcool acetona;

- lavar com água;

- corar com fucsina fenicada por 30 segundos;

- lavar com água, secar e observar em objetiva de imersão.

b.4) Resultado:

- células Gram positiva – roxo escuro

- células Gram negativa – avermelhadas (rosada)





2.2) Coloração por azul de metileno

A) Material necessário:

- Lâmina para microscopia;

- lápis para vidro;

- alça de platina;

- tubo contendo solução salina esterilizada;

- cultura de bactérias Gram positiva e negativa;

- microscópio, óleo de imersão, papel absorvente;

- suporte para lâminas;

- secador de cabelo.


B) Procedimento:

b 1) Esfregaço:

- flambar rapidamente uma lâmina de microscopia limpa, nos dois lados, “cortando” lentamente a chama do bico de Bunsen;

- identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço;

-flambar a alça de platina até o rubro e, a seguir, deixá-la esfriar, conservando-a toda via perto da chama;

- tomar o tubo de cultura com a mão esquerda e com os dedos mínimo e anelar da mão direita remover o lampião da boca do tubo;

- flambar a boca do tubo de cultura;

- introduzir a alça de platina, apreendida entre o polegar e o indicador da mão direita, no interior do tubo até tocar o meio de cultura – retirar a alça;

- flambar novamente a boca do tubo de cultura;

- fechar o tubo com o tampão e colocá-lo na estante;

- tomar uma lâmina (anteriormente preparada) com a mão esquerda e depositar no centro da mesma a gotícula de suspensão bacteriana;

- espalhar o material com movimentos de rotação da alça de platina, para se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme, secar naturalmente;

- esfregaço nas proximidades da chama ou utilizar o secador de cabelo para auxiliar na secagem.
b.2) Fixação:

- fixar o esfregaço, “cortando” lentamente a chama por três vezes, a fim de que o material fique bem aderente à lâmina. A fixação é sempre feita do lado contrário ao esfregaço bacteriano.


b.3) Técnica:

- fazer um esfregaço bem homogêneo, fixar pelo calor e esperar esfriar;

- cobrir com o corante (azul de metileno) e deixar por 1 minuto;

- lavar rapidamente em água, secar e observar em objetiva de imersão.


b.4) Resultado:

2.3) Coloração de esporos: Wirtz-Conklin

A) Material necessário:

- duas lâminas para microscopia;

- suporte para lâmina;

- corante verde malaquita;

- corante safranina ou fucsina fenicada;

- cultura de bactéria esporuladas (B. subtilis);

- lápis para vidro;

- microscópio, óleo de imersão, papel absorvente.

B) procedimento:

b.1) Técnica: - fazer esfregaço da cultura bacteriana, fixar e corar pelo Wirtz-Conklin, conforme segue:

* corar por 4 minutos com solução de verde malaquita a quente;

* deixar esfriar e lavar em água;

* corar por 1 minuto com safranina a frio;

* lavar com água, deixar secar e observar em imersão.
b.2) Resultado:

- esporos coram-se em verde, formar vegetativas em vermelho.





2.4) Coloração de bactérias álcool-ácido resistentes: Ziehl - Neelsen

A) Material necessário:

- esfregaço preparado de material de escarro de paciente tuberculoso já fixado, dentro de placa de petri;

bateria para coloração de Ziehl (fucsina de Ziehl, álcool-ácido, azul de metileno);

- suporte para lâmpada;

- grampo para lâminas;

- microscópio e óleo de imersão, papel absorvente.
B) Procedimento:

b.1) As micobactérias dificilmente adquirem colorações convencionais (GRAM), necessitando, portanto, de colorações especiais. A parede celular destas bactérias permite coloração pela fucsina apenas quando a temperatura é elevada (coloração a quente).

b.2) Técnica:

- corar com fucsina de Ziehl concentrada, aquecendo a lâmina até a emissão de vapores, durante 5 minutos. Não deixar ferver nem secar;

- escorrer o corante e diferenciar com álcool-ácido (álcool a 95% e ácido clorídrico a 1%). Tempo delicado, aproximadamente 15 segundos;

- lavar em água corrente;

- corar o fundo durante 30 segundos com solução aquosa diluída de azul de metileno;

- lavar e secar;

- observar em imersão.
b.3) Resultado:

- encontrar bacilos corados em vermelho, contrastando com outros microorganismos e núcleos celulares em azul.





P R Á T I C A 3 – M e i o d e c u l t u r a – á g a r – n u t r i e n t e
Meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial das bactérias. Esses meios são substratos adequados ao crescimento, multiplicação e desenvolvimento de microorganismos fora de seu hábito natural.


  1. Material necessário:

- placa de petri;

- erlenmeyer;

- balança;

- substâncias como: extrato de carne, peptona, extrato de levedura, agar-àgar e água destilada;

B) Procedimento:

- Pesagem das substâncias:

*10g de extrato de carne;

*15g de peptona;

*1g de extrato de levedura;

*13g de agar – agar;

*1000ml de água destilada;

- adicionar essas substâncias em um erlenmeyer, homogeneizar e completar com água;

- fechar o erlenmeyer com uma “bucha”;

- colocar na autoclave a 121ºC por 20 minutos para sua esterilização;

- esterilizar as placas de petri a 170ºC por 2 horas na estufa de esterilização;

- limpar a bancada para obter um ambiente livre de bactérias(contaminação)

- distribuir o meio em placas de petri;

- armazenar as placas contendo o meio, embrulhados em plásticos e guardados na geladeira.


P R Á T I C A 4 E s t e r i l i z a ç ã o – C o n t r o l e m i c r o b i a n o

É o ato ou processo de destruir ou eliminar todas as formas vivas de um material ou ambiente.




  1. Esterilização por calor úmido - autoclave

a.1) Procedimento:

- verificar se a resistência da autoclave (que fica no fundo do aparelho) está coberta com água;

- Colocar o material devidamente acondicionado;

- fechar a tampa e ligar o aparelho, deixando a válvula de escape aberta;

- quando o vapor sair de forma contínua, fechar a válvula;

- quando a temperatura atingir 121ºC, inicia a contagem de tempo de esterilização, geralmente 15 a 30 minutos;

- desligar o aparelho e esperar o ponteiro do monômetro chegar a zero, para então abrir a válvula de escape, pois em caso contrário a água entra em ebulição;

- abrir a autoclave somente quando a pressão interna for igual à externa.
B) Esterilização por calor seco – Estufa

b.1)Procedimento:

- colocar o material devidamente acondicionado (embrulhado em papel), sem sobrecarregar o forno;

- ligar o aparelho, regulando a temperatura de 160 ou 170ºC, por meio do termostato;

- esperar que o aparelho atinja a temperatura desejada, controlando sempre por um termostato colocado no orifício que se encontra na parte superior do aparelho;

- a partir desse momento, iniciar a contagem do tempo de esterilização por duas horas;

- abrir a estufa somente quando a temperatura interna atingir valores próximos à do ambiente.


P R Á T I C A 5 - A t i v i d a d e a n t i m i c r o b i a n a d o s s a n e a n t e s

Saniantes são substâncias ou produtos capazes se destruir, indiscriminadamente, os microrganismos de um superfície ou instrumento, sem, entretanto eliminar as formas esporuladas.




  1. Material necessário:

-Tubo contendo cultura em meio liquido (5ml) dos seguintes microorganismos:

* Escherichia coli



* Candida albicans

* Bacillus stearothermophilu

* Staphylococcus aureus

- Um tubo contendo 5ml de solução salina esterilizada;



- Diferentes tipos de desinfetantes em tubos de ensaio;

- Uma placa de petri contendo ágar – nutriente (Mueller Hinton);

- Alça de platina;

- Uma pipeta.





  1. Procedimentos:

- de acordo com as instruções no rótulo do produto, realize as diluições de cada produto;

- Pipetar 0,5 ml do microrganismo a ser utilizado (cada aluno deverá realizar o experimento com um microorganismo) e transferir para um tubo contendo solução salina e para os tubos dos diferentes desinfetantes;

- Aguardar 15 minutos;

- dividir o fundo da placa contendo ágar – nutriente com lápis para vidro, marcar os desinfetantes correspondentes;

- Semear com alça de platina a partir dos tubos com desinfetantes + microorganismos, para os ¼ correspondentes da placa;

- Incubar a 37 ºC durante 48 horas.

b.1)Resultados:

- Observar o crescimento nas partes correspondentes à ação de cada desinfetantes, nas placas semeadas. Contar o numero de colônias (quando possível)



P R Á T I C A 6 - E f e i t o s d o c a l o r s o b r e o c r e s c i m e n t o

d e m i c r o r g a n i s m o s.

A) Material necessário:

- Um tubo contendo cultura de microrganismos (Bacillus stearothermophilus, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Escherichia coli);

- Uma placa de petri contendo ágar – nutriente (Mueller Hinton);

- alça de platina;

- pinça de madeira;

- banho maria;

- lápis para vidro.

B)Procedimento:

- Dividir o fundo da placa de petri contendo ágar-nutriente em quatro partes, identificar (nome e número) e marcar (0, 5, 10, e 20 minutos);

- Semear com alça de platina o microorganismo no tubo ¼ correspondente ao tempo = 0 na placa;

- Colocar o tubo em banho-maria fervente durante 5 minutos. Retirar e semear com alça de platina no 1/4 correspondente;

- Colocar novamente o tubo no banho-maria, aguardar 5 minutos (t=10), retirar e semear com alça de platina no ¼ correspondente;

- Repetir a operação deixando o tubo no banho-maria fervente por mais 10 minutos (t = 20), retirar e semear com a alça de platina no ¼ correspondente.


E S Q U E M A D O P R O C E D I M E N T O A S E R S E G U I D O





T=5


T=0






T=10

T=20

Cultura de

microrganismo

b.1) Interpretação: Observar onde ocorreu o crescimento nas partes correspondentes da placa de petri semeada





Microrganismo

0’

5’

10’

20’















































P R Á T I C A 7 - S e n s i b i l i d a d e a o s a n t i b i ó t i c o s i n V I T R O :

A N T I B I O G R A M A


A) Material necessário:

- cultura de microorganismos a serem testada (Gram +: staphylococcus sp, Gram - : E. Coli );

- lâminas de microscopia;

- alça de platina;

- bateria de coloração de Gram;

- dois swabs esterilizados;

- duas placas de petri contendo meio para antibiograma (Mueller – Hinton ou BHI);

- duas pinças esterilizadas;

- discos de antibióticos (série Gram positiva e gram negativa).

B) Procedimento:

- fazer um esfregaço da cultura a ser utilizada, corar pelo método da Gram (cultura pura do microorganismo em caldo, com 24 horas de incubação). A finalidade da lâmina é observar morfologia e características de coloração, para orientar a escolha de antibióticos a serem testados;

- molhar o swab esterilizado na cultura de microrganismos, retirar o excesso nas paredes do tubo e espalhar de forma homogênea as bactérias sobre a superfície do meio da cultura;

- colocar assepticamente, com auxílio de pinça esterilizada, discos de papel contendo antibióticos com concentrações conhecidas (encontrada pronto no comércio), sobre a superfície do meio que foi previamente semeado, procurando distribuir os discos simetricamente. Os discos devem distar um do outro 3 a 4 cm e da borda da placa cerca de 2,5 cm. As placas serão incubados a 37ºC e os tubos de inibição medidos após crescimento bacteriano.
b.1) Escolha dos antibióticos:

- embora em muitos casos uma infecção possa ser tratada com sucesso sem realizar culturas, deve-se SEMPRE fazer provas de sensibilidade para as bactérias isoladas nas culturas em cada um dos casos, dado que diferentes amostras de bactérias podem apresentar diferentes sensibilidades aos antibióticos. Os produtos para culturas devem ser coletados antes de se iniciar a administração dos antibióticos. Se não ocorrer resposta clínica, devem-se fazer culturas repetidas.


b.2) Resultados:

- A interpretação dos resultados é feita medindo-se os halos de inibição do crescimento bacteriano, nas placas semeadas na aula passada, ao redor dos discos com antibióticos. A medida é feito em mm e comparada com tabelas fornecidas pelos fabricantes do disco indicando resistência (R), grau intermediário (I) ou sensibilidade (S)


b.3) CIM ( Concentração inibitória mínima) e CBM (Concentração bacteriana mínima)

- CIM, é a concentração de antibiótico no sítio da infecção, necessária para inibir o crescimento da bactéria infectante.

- CBM, é a concentração de antibiótico no sítio da infecção necessária para matar a bactéria infectante.

C) Difusão:

- Preparar o inoculo do microorganismo a ser testado e transferir 4 a 6 colônias para caldo Mueller – Hinton. Incubar por 2 a 8 horas a 35-3 7ºC de modo a se obter uma turbidez moderada(densidade de 0,5ml na escala de MacFarland – aproximadamente 108 UFC/mL do inoculo). Semear 0,1mL dessa cultura para a placa de ágar Mueller – Hinton através de swab ou pipeta.

- Colocar os discos impregnados com antibióticos sobre a superfície do ágar inoculado com uma pinça estéril, pressionando levemente e mantendo um espaçamento de modo que fiquem suficientemente separados uns dos outros para evitar a superposição dos halos de inibição. Incubar as placas por 48 horas a 35-3 7ºC.


c.1) Resultados:

- A leitura das placas deverá ser feita, medindo-se o diâmetro dos halos de inibição (incluindo o diâmetro do disco), e comparando com os dados da tabela. Classificar os microorganismos como resistentes, sensível e intermediário.



E X E M P L O de resistência intermediária e sensível


CIM




250

150


100

50

25



20

10

5



2


resistente


R


intermediária

S



sensível

10 20 30 diâmetro mm





P R Á T I C A 8 – E x p e r i m e n t o d e a n a e r o b i o s e
A) Material necessário: microrganismos com crescimento positivo em anaerobiose.

- Uma jarra hermeticamente fechada (lacrada);

- produto anaero GEN;

- placa de petri com meio de cultura;

- alça de platina;

B) Procedimento: Quando o anaero GEN é colocado em uma jarra hermeticamente fechada, o oxigênio atmosférico da jarra e rapidamente absorvido, com transformação em dióxido de carbono. Este método difere dos métodos comuns, pois a reação continua sem produção de hidrogênio, assim, portanto, não requer um catalisador e não é necessária a adição de água para ativar a reação.


b.1) Técnica:

- Colocar na jarra hermeticamente fechada placas de petri com meio de cultura semeado alguns microrganismos de características anaerobiótica.

- Aplicar o anaero GEN, abrindo-o de sua embalagem, colocar na jarra e fechar (lacrar) hermeticamente a jarra;

- Incubar em 24horas a 37 ºC.
b.2) Resultados: Depois do período de incubação determinado pelo professor ou monitor, retirar a placa da jarra e verificar se ocorrer crescimento de microorganismo.

P R Á T I C A 9 - T r a n s m i s s ã o e c o n t r o l e d e E p i d e m i a

a r t i f i c i a l d e m i c r o r g a n i s m o


A) Material necessário:

- 01 par de luvas – estéril;

- 02 “Swabs”;

- 01 tubo com salina estéril;

- 01 alça bacteriológica;

- 01 frasco com polvidine;

- 01 placa de petri com uma bala.
B) procedimentos:

b.1) As principais razões para o emprego de métodos de controle dos microorganismos são:

- prevenir a transmissão de doenças infecto-contagiosas;

- prevenir a detereorização de alimentos;

- prevenir ou controlar contaminações indesejáveis.
b.2) Técnica:

- cada grupo de 02 estudantes receberá uma bala contida numa placa de petri. Algumas dessas balas estarão contaminadas com um microrganismo de baixa patogenicidade. Um dos membros do grupo colocará o par de luvas e passará a esfregar a bala que receber, na mão enluvada. A seguir a bala deve ser guardada na placa, para posterior esterilização. Cuidado para não contaminar a bancada, pois seus colegas podem se contaminar, ou mesmo o pessoal da limpeza. Esse indivíduo deverá apertar a mão de um outro colega, também enluvado. Essa fase do exercício dever ser realizada com ordem e dissipada, a fim de que o professor ou monitor possa anotar a seqüência do aperto das mãos. O outro colega do grupo colherá com um “swab” estéril, umedecido e salina estéril, material da luva da mão do colega que foi usada nos apertos de mãos, e a seguir fará a semeadura desse material em um dos hemisférios da metade da placa. Numa segunda fase, o estudante enluvado deverá lavar as mãos, de forma adequada, com o uso de água e polvidine. Após secar as mãos enluvadas com papel toalha, o colega do grupo fará nova colheita com o outro “swab” estéril umedecido em salina estéril, que deverá ser semeado, como anteriormente, na outra metade da placa de ágar - sangue.

O aluno enluvado deverá retirar a luva e colocá-la em lugar apropriado designado pelo professor ou monitor, para posterior descarte. O estudante que semeou a amostra deverá identificar a placa designando corretamente os hemisférios da placa de ágar-sangue correspondente a 1ª e 2ª fase de estudo, além de anotar o número de bala recebida e número de componentes do grupo. A seguir colocar em estufa de 37ºC por 24 horas. Ambos os membros do grupo, antes de finalizar os trabalhos, deverão lavar as mãos com água, sabão e álcool 70%
b.3) resultado:

- No dia seguinte cada grupo pegará sua placa e deverá examiná-la quanto a presença de microorganismos em ambas as fases do estudo e discutir os resultados quanto à transmissão e controle de epidemia artificial.



OBS: Esta prática tem por objetivo, também treinar o aluno nas técnicas de colheita, semeadura e a análise das características da colônia obtida.

P R Á T I C A 10 - T é c n i c a d e s e m e a d u r a
A) Material necessário:

- 01 tubo com meio líquido semeado com staphylococcus sp;

- 01 tubo com suspensão contendo estafilococos e E. coli;

- uma placa contendo agar-sangue para semeadura em superfície;

- uma placa esterilizada e 01 tubo contendo 20 ml de ágar simples aquecido a temperatura de 50ºC (para semeadura em profundidade);

- 01 pipeta de 1ml esterilizada;

- 01 lápis para vidro;

- 01 tubo com ágar inclinado;

- 01 tubo com meio líquido;

- alça de platina;


B) Procedimento:

- os procedimentos devem ser realizados na área de imunidade da chama do bico de Bunsen


b.1) Repique em meio líquido

- segurar a alça de platina com a mão direita, flambar até o rubor, deixar a alça esfriar perto da chama, pegar o tubo contendo a cultura bacteriana com a mão esquerda, retirar o tampão do tubo com o dedo mínimo e anelar da mão direita, flambar a boca do tubo, introduzir a alça de platina até tocar o meio, retirá-la com uma gota do meio, flambar novamente a boca do tubo, recolocar o tampão, colocar o tubo na estante (este procedimento deve ser repetido para semeadura em B2, B3, B4)

- pegar o tubo com meio líquido estéril com a mão esquerda, retirar o tampão com o dedo mínimo da mão direita, flambar a boca do tubo, colocar a alça carregada com microorganismo no interior do tubo até atingir o meio e agitar delicadamente. Retirar a alça, flambar novamente a boca do tubo, recolocar o tampão, colocar o tubo na estante, flambar a alça de platina.

OBS: - Nunca colocar o tampão do tubo sobre a bancada

- Cada aluno deve realizar a semeadura sem ajuda do companheiro, pois o aprendizado de semeadura também faz parte das aulas.

- Antes de iniciar o repique, certifique-se que o material necessário encontra-se próximo.

- Identificar os tubos de cultura e as placas semeadas.


b.2) Técnicas em meio sólido por picada

- carregar a agulha de platina, procedendo como a primeira parte de “B1”;

- o repique deverá ser feito introduzindo-se a agulha de platina dentro do ágar. Repetir, perfurando o ágar por três vezes.
b.3) Semeadura por esgotamento em ágar-inclinado:

- carregar a laça de platina como a descrita em “B1”;

- o repique é feito colocando-se a alça carregada o mais profundo possível dentro do tubo, sem tocar o meio. Em seguida encostar delicadamente a ponta da alça na superfície do ágar e proceder a semeadura com movimentos de vai-vém.
b.4) Semeadura por esgotamento em placa de petri:

- Dividir o fundo da placa de petri contendo ágar-sangue em 3 partes, com lápis para vidro;

- carregar a alça como em “B1”;

- abrir a placa com a mão esquerda, encostar a alça contendo microorganismo na borda do 1/3 delimitado na placa. A seguir iniciar a semeadura em estrias, mais próximas inicialmente e, a seguir, distanciar as estrias. A seguir semear as outras 2/3, sem carregar a alça. Evitar passar a alça duas vezes no mesmo local e procurar aproveitar toda a superfície do meio sem “machucar” o mesmo.


b.5) Semeadura em placa de em Pour Plate

- Semear com pipeta esterilizada 0,1 ml de suspensão contendo bactérias, no fundo de placa de petri esterilizada;

- verter o meio de cultura (ágar simples) dissolvida a 40 – 45ºC;

- submeter a placa a movimentos rotatórios suaves, com a finalidade de misturar o inoculo, com o ágar;

- esperar solidificar o meio;

- o objetivo da técnica de semeadura em Pour Plate é obter colônias isoladas (qualitativo) ou para realizar contagem de colônias em placas (quantitativo). Nesta técnica deve-se tomar cuidado para não adicionar o meio em temperatura elevada sobre o inóculo o que poderá matar as bactérias.



P R Á T I C A 11- M o r f o l o g i a d a s c o l ô n i a s
As características que os microrganismos apresentam ao crescer em meios de culturas são expressões fenotípicas do material genético e, portanto, são muito úteis na sua identificação. Embora muitas vezes elas sejam consideradas de importância secundária e utilizadas apenas na identificação preliminar, em muitos casos elas são essenciais e, às vezes, representam a única característica que permite a distinção e a identificação dos espécimes.
Nas placas podemos observar as características das colônias:

- tamanho (mm);

- morfologia (forma, bordo ou margem e elevação);

- pigmentação (cor, solubilidade, fluorescência, rugosidade);

- aspecto (brilho, transparência, opacidade, rugosidade);

- consistência (butirosa ou amanteigado, viscosa, membranosa, seca, quebradiça).


Morfologia das colônias

Objetivo:

- Observar e descrever as características culturais de cultura.


Procedimentos:
- inocular as culturas em placas, ágar nutriente. - Incubar a temperatura adequada por 24-48 horas.

- Realizar as leituras e preencher a ficha de avaliação com os resultados.


Avaliação: Preencher na ficha de avaliação os resultados


A v a l i a ç ã o

C u l t u r a s

1

2

3

4

Colônias tamanho (mm)













Forma













Elevação













Bordo













Pigmentação cor













Aspecto













Consistência














Bibliografia
SILVA FILHO, Germano Nunes / Ventúria Lopes de Oliveira. Microbiologia: manual de aulas práticas. Florianópolis: ed. da UFSC, 2004

MARSHALL, Jacquelyn R. Manual de Laboratório Clínico: Microbiologia. 1.ed. São Paulo: Livraria Santos, 1995.



JORGE, Antonio O. Cardoso. Microbiologia: Atividades práticas. 2.ed. São Paulo: Livraria Santos, 2001.




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