西瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare的分子检测 唐建辉1,王 伟1,王源超2




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中国农业科学 2006,39(10):2028-2035

Scientia Agricultura Sinica


西瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare的分子检测

唐建辉1,王 伟1,王源超2

(1华东理工大学海洋生化工程研究所 /生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237; 2南京农业大学植物保护学院/农业部植物病虫监测与治理重点开放实验室,南京 210095)

摘要:【目的】探索西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare )的分子检测技术,为西瓜、甜瓜等生长期和采后炭疽病的快速、准确鉴定和检测提供技术和方法。【方法】根据GeneBank中Colletotrichum属的24个种ITS序列,比较设计出1对引物CY1/CY2(CY1: 5′-CTTTGTGAACATACCTAACC-3′; CY2: 5′-GGTTTTACGGCAGGAGTG-3′);进一步利用RAPD随机引物扩增西瓜炭疽菌C.orbiculare和菜豆炭疽菌C.lindemuthianum,找出在C.orbiculare中的特异性条带,经过克隆、测序后,设计出1对SCAR引物RB/RC。【结果】引物CY1/CY2可以特异的从C.orbiculareC.lindemuthianum菌株中扩增到1条442 bp的条带,将这2个种的炭疽菌和其它炭疽菌种以及其它真菌种分开。引物RB/RC可以特异地在C.orbiculare中扩增出1条216 bp条带,将C.orbiculareC.lindemuthianum分开。采用2对引物组成双重PCR,将C.orbiculare进行特异性扩增,可获得442 bp和216 bp的2条特异性条带。【结论】利用上述2对引物组成双重PCR检测体系,快速鉴定C. orbiculare并且能够直接在植物组织中将西瓜炭疽菌C. orbiculare检测出来,灵敏度可以达到1pg·µl-1

关键词:西瓜炭疽病;Colletotrichum orbiculare;分子检测;双重PCR
Molecular Detection of Colletotrichum orbiculare

TANG Jian-hui1, WANG Wei1, WANG Yuan-chao2



(1Institute of Marine Bioprocess Engineering / State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237; 2 Key Laboratory of Monitoring and Management of Plant Diseases and Insects, Ministry of AgricultureCollege of Plant Protection, Nanjing Agricultural UniversityNanjing 210095)
Abstract:【Objective】A duplex PCR was developed to detect Colletotrichum orbiculare, a causal agent of watermelon anthracnose, in infectedd leaves and fruits. 【Method】 Based on the differences of ITS DNA sequences of 24 species of Colletotrichum from GenBank, a couple of specific primers of CY1/CY2 (CY1: 5′-CTTTGTGAACATACCTAACC-3′; CY2: 5′-GGTTTTACGGCAGGAGTG-3′) were synthesized. By RAPD technique, a band from C. orbiculare was specific amplified, and then the band was cloned, sequenced and used to design specific primers of RB/RC (RB: 5′-GCTGTCACTTTGTGGTGTG-3′; RC: 5′-TGTCGTAGCCCATCTTGTC-3′) for this species. 【Result】Using CY1/CY2 primers, only a single PCR band of 442 bp from C. orbiculare and C. lindemuthianum was amplified and no PCR band from other species. The RB/RC primers could identify and distinguish C. orbiculare from C. lindemuthianum the 216 bp PCR band. A duplex PCR method, combining primers CY1/CY2 and RB/RC, was used to detect C. orbiculare. The detection sensitivity with the two couples of primers was 1pg·μl-1 of genomic DNA. 【Conclusion】The PCR-based method could be used for the accurate and rapid identification of C. orbiculareon watermelon in the growth stage and postharvest.

Key words: Watermelon anthracnose; Colletotrichum orbiculare; Molecular detection; Duplex PCR



0 引言


【本研究的重要意义】西瓜炭疽菌[Colletotrichum orbiculare(Berk. et Mont.)Arx]能引起西瓜、甜瓜等瓜类炭疽病,该病在世界各地普遍发生,无论是在保护地还是在露地栽培中发病都比较严重,一旦病害发生,就会严重减产,甚至绝收[1]。除在生长期发生外,炭疽病也是引起西瓜和甜瓜采后腐烂变质的主要原因之一。由于病原菌在采收前侵染,采收后储藏和运输过程中发病,造成瓜果严重腐烂,货架期短,不能储藏和长途运输[2]。因此,快速、准确地在发病前或初期以及收获时对病菌的侵染动态进行检测,及时采取有效的防治方法对控制病害在田间和储运中的发生、减少经济损失具有十分重要的意义。【前人研究进展】传统炭疽病菌的分类和鉴定主要基于形态学特征、致病性测定等[3]。传统的病菌鉴别方法耗时长、灵敏度低以及经验性强,从发病植株中分离并鉴定病原菌需要数天时间,难以做到对病害发生的及时监测和有效控制病原菌的传播与病害流行。同时,传统的检测方法在瓜类储藏和运输之前,不能明确炭疽病菌潜伏侵染的状况,造成已被炭疽病菌侵染的西瓜和甜瓜在储运过程中大量腐烂,产生巨大损失。随着分子生物学的发展,不同分子技术用于植物炭疽病的检测,Sreenivasprasad等[4]根据ITS序列,设计出引物CaInt2/ITS4对C. acutatum 进行特异性检测。Natalia等[5]根据ITS序列设计出C. gloeosporioides的检测引物CaInt/ITS4,并用来对巴西果树采后病害进行监测。【本研究切入点】Martinez Culebras等[6, 7]不仅利用ITS序列设计出了Colletotrichum 属的检测引物,还利用RAPD转SCAR标记的方法设计出了对C. fragariae的检测引物。Dauch等[8]则利用RAPD转SCAR标记对Colletotrichum coccodes(183088)进行了检测。此外,线粒体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析[9]、同工酶分析[10]等也用于炭疽菌的检测。张欣[11]对胶胞炭疽菌C. gloeosporioides也进行了一些检测工作。目前,尚未见有关瓜类炭疽菌Colletotrichum orbiculare分子检测的报道。【拟解决的关键问题】本研究拟通过Colletotrichum属的ITS系列设计出1对引物,进一步利用RAPD扩增,设计出1对SCAR引物,利用上述两对引物组合成双重PCR检测体系,用于C. orbiculare的检测。为西瓜、甜瓜炭疽菌的准确鉴定和快速检测提供技术和方法。

1 材料与方法


1.1 供试菌株

本研究供试菌株种名、寄主、来源及相关特性见表1。

1.2 菌丝体培养与收集

将供试的西瓜炭疽菌在PDA平板上25℃培养7 d后,从菌落边缘切取菌丝块转至PDB液体培养基中(每250 ml锥形瓶中装100 ml培养液),28℃,100 r/min振荡培养7 d,过滤收集菌丝,经冷冻抽干研磨成菌丝粉,﹣20℃保存备用。

1.3 菌丝基因组DNA的提取

取少量菌丝粉,采用CTAB法提取DNA,加适量灭菌超纯水(含20 μg·ml-1 RNase)溶解DNA,37℃处理1 h后,﹣20℃保存备用。

1.4 西瓜发病组织上DNA的快速提取

参考Hong等[12]的方法并改进:取一段新发病的植物组织(叶片或果皮),每克组织加入50 µl 0.5 mol·L-1 NaOH,研磨后,12 000 r/min离心5 min,取5 µl上清液加入495 µl 0.1 mmol·L-1 Tris(pH 8.0),混匀后备用。

1.5 引物设计及PCR扩增

1.5.1 引物CY1/CY2的设计 根据GenBank中登录的Colletotrichum属的24个种的ITS序列,利用Bioedit软件分析,设计出一对引物CY1/CY2,序列如下:

CY1: 5′-CTTTGTGAACATACCTAACC-3′

CY2: 5′-GGTTTTACGGCAGGAGTG-3′。

1.5.2 引物CY1/CY2的PCR扩增 PCR的反应混合液总体积为25 µl:包括2.5 µl 10×PCR反应缓冲液,2 µl 2.5 mmol·L-1 Mg2+,20 µmol·L-1的引物各0.25 µl,4种浓度为2.5 mmol·L-1的dNTP各1 µl,1.25单位Taq酶,模板DNA 10 ng,离心后加1滴石蜡油,在PTC-200 PCR仪上扩增。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,62℃退火30 s,72℃延伸1 min,共32个循环,最后72℃延伸7 min。反应结束后,取8 μl样品在1.0%的琼脂糖凝胶(含终浓度0.5 μg·ml-1的溴化乙锭)于1×TAE中电泳,用Bio-rad凝胶成像系统照相。

1.5.3 随机引物对西瓜炭疽病菌和菜豆炭疽病菌的RAPD扩增 50条随机引物(上海生工合成),对C. orbiculareC. lindemuthianum进行RAPD扩增。PCR的反应混合液总体积为25 µl:包括2.5 µl 10×PCR反应缓冲液,2 µl 2.5 mmol·L-1 Mg2+,10 µmol·L-1的引物





表1 用于特异性引物筛选的供试真菌菌株

Table 1 Isolates of different fungi used to screen the primers specificity

菌株

Species


寄主

Host


来源

Locality


数量

Number of isolates



扩增引物 Amplification with primers

ITS1/ITS4

CY1/CY2

RB/RC

C.orbiculare

Citrullus lanatus

郑州 Zhengzhou

1

+

+

+

C.orbiculare

Citrullus lanatus

山东 Shandong

1

+

+

+

C.orbiculare

Citrullus lanatus

保定 Baoding

1

+

+

+

C.orbiculare

Citrullus lanatus

上海 Shanghai

2

+

+

+

C.orbiculare

Citrullus lanatus

黑龙江 Heilongjiang

2

+

+

+

C.orbiculare

Citrullus lanatus

江西 Jiangxi

1

+

+

+

C.orbiculare

Citrullus lanatus

吉林、辽宁 Jilin, Liaoning

8

+

+

+

C.orbiculare

Citrullus lanatus

南京 Nanjing

2

+

+

+

C.orbiculare

Citrullus lanatus

杭州 Hangzhou

2

+

+

+

C.lindemuthianum

Phaseolus vulgaris

上海 Shanghai

2

+

+



C.lindemuthianum

Phaseolus vulgaris

杭州 Hangzhou

3

+

+



C.lindemuthianum

Phaseolus vulgaris

黑龙江 Heilongjiang

1

+

+



C.lindemuthianum

Phaseolus vulgaris

江西 Jiangxi

1

+

+



C.lindemuthianum

Phaseolus vulgaris

南京 Nanjing

3

+

+



C.acutatum

Fragaria ananassa

上海 Shanghai

1

+





C.capsici

Capsicum annuum

南京农业大学 NAU

2

+





C.coccodes

Capsicum frutescens

南京农业大学 NAU

1

+





C.destructivum

Anthurium andraeanum

广州 Guangzhou

5

+





C.gloeosporioides

Malus pumia

上海、南京、杭州等

Shanghai, Nanjing, Hangzhou



50

+





C.higgisianum

Bassica

南京农业大学 NAU

3

+





C. musae

Musa nana

福建省农业科学院 FAAS

1

+





C.truncatum

Glycine max

南京农业大学 NAU

1

+





Alternaria atrans

Glycine max

南京农业大学 NAU

1

+





Alternaria solani

Lycopersicum esculentum

南京农业大学 NAU

1

+





Alternaria longipes

Nicotiana tabacum

福建省农业科学院 FAAS

1

+





Ascochyta fabae

Vicia faba

福建省农业科学院 FAAS

1

+





Botrytis cinerea

Lycopersicon esculentum

南京农业大学 NAU

1

+





Botrytis cinerea

Lactuca scariola

福建省农业科学院 FAAS

1

+





Cryphonectria parasitica

Castanea mollissima

南京农业大学 NAU

1

+





Fusarium oxysporum

Citrullus lanatus

本试验室保存 This Lab

3

+





Fusarium oxysporum

Citrullus lanatus

南京农业大学 NAU

10

+





Fusarium oxysporum

Cucumis sativus

南通 Nantong

1

+





Fusarium culmorum

Unknow

CGMCC

1

+





F.oxysporum f.sp.cubense

Musa sapientum

福建省农业科学院 FAAS

1

+





F. avenaceum

Unknow

CGMCC

1

+





F. nivale

Unknow

CGMCC

1

+





F. verticilloides

Gossypium

江苏省农业科学院 JAAS

1

+





Macrophoma kawatsukai

Malus pumila

南京农业大学 NAU

1

+





Mycosphaerella melonis.

Citrullus lanatus

南京农业大学 NAU

10

+





Phytophthora sojae

Glycine max

南京农业大学 NAU

1

+





Phytophthora boehmeriae

Gossypium

南京农业大学 NAU

1

+





Phytophthora colocasiae

Colocasia esculentum

南京农业大学 NAU

1

+





Phytophthora drechsleri

Lycopersicon eslulentum

南京农业大学 NAU

1

+





Phytophthora. medicaginis

Medicago

南京农业大学 NAU

1

+





Pythium aphanidermatum

Citrullus lanatus

本试验室保存 This Lab

1

+





Rhizoctonia solani

Cucumis melo

福建省农业科学院 FAAS

1

+





Verticillium dahliae

Gossypium

福建省农业科学院 FAAS

1

+





“+”为有扩增产物;“−”为无扩增产物;CGMCC:中国普通微生物菌种保藏管理中心

“+”a single PCR band; “−”no PCR band; NAU: Nanjing Agricultural University; FAAS: Fujian Academy of Agricultural Sciences; JAAS: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences; CGMCC: China General Microbiological Culture Collection Center;




1 µl,4种浓度为2.5 mmol·L-1的dNTP各2 µl,1.25单位Taq酶,模板DNA 10ng,离心后加1滴石蜡油,在PTC-200 PCR仪上扩增。反应程序为:94℃预变性2 min;94℃变性45 s,37℃退火1 min,72℃延伸1 min,共计40个循环,最后72℃延伸10 min。反应结束后,取8 μl样品在1.5%的琼脂糖凝胶(含终浓度0.5 μg·ml-1的溴化乙锭)于1×TAE中电泳,用Bio-rad凝胶成像系统照相。

1.5.4 PCR产物的纯化、克隆和测序 利用DNA回收纯化试剂盒回收引物S1091在西瓜炭疽病菌上扩增到的一条特异性片段。回收后的DNA连接到PMD-18 T-vector中后转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中,最后鉴定出阳性转化子,经穿刺接种后,送往北京三博公司测序。

1.5.5 测序结果的分析及SCAR引物的设计 测序结果显示这条特异性条带为441 bp,利用Primer Premier5.0软件分析,引物设计如下:

RB:5′-GCTGTCACTTTGTGGTGTG-3′

RC:5′-TGTCGTAGCCCATCTTGTC-3′。

1.5.6 RB/RC对西瓜炭疽菌和菜豆炭疽菌的扩增 PCR的反应体系以及反应程序见1.5.2。

1.6 西瓜炭疽菌分子检测体系的建立

利用CY1/CY2和RB/RC引物组成双重PCR,对西瓜炭疽病菌、菜豆炭疽病菌及其它相关和近似菌株进行检测。反应体系为25 μl:除20 µmol·L-1的引物各0.5 µl外,其它反应体系及反应程序见1.5.2。

1.7 引物灵敏度的检测

对CY1/CY2,RB/RC以及由二者组成的双重PCR的反应进行灵敏度的检测。DNA浓度从DNA10 ng·μl-1开始依次10倍稀释至100 ag·μl-1。反应体系和反应程序见1.5.2。

1.8 西瓜发病组织的快速检测

利用1.6建立的检测体系,对西瓜炭疽病发病叶片、西瓜炭疽病发病果实进行检测。

2 结果与分析

2.1 CY1/CY2对西瓜炭疽菌和菜豆炭疽菌特异性检测



根据Colletotrichum属24个种的ITS序列差异设计的引物CY1/CY2只能从供试的20个C. orbiculare和10个C. lindemuthianum菌株DNA中扩增出442 bp的条带,而其它63个Colletotrichum属的菌株和54个相关和近似菌株及空白对照均无扩增条带(表1,图1),表明该引物能将C.orbiculareC. lindemuthianum与其它菌株分开。

2.2 S1091对西瓜炭疽菌和菜豆炭疽菌扩增

50条RAPD随机引物对C.orbiculareC. lindemuthianum扩增后,引物S1091(5′-GTCACG TCCT-3′)能在C. orbiculare上产生一条441 bp的特异性条带(图2)。

2.3 RB/RC对西瓜炭疽菌和菜豆炭疽菌扩增

根据随机引物S1091在C. orbiculare上扩增出的441 bp特异条带设计出的引物RB/RC,对供试的C. orbiculareC. lindemuthianum进行扩增,只有C. orbiculare能扩增出216 bp的片段,C. lindemuthianum和空白对照均无条带,表明该引物能将西瓜炭疽菌和菜豆炭疽菌分开(图3)。

2.4 西瓜炭疽菌分子检测体系建立





M:DL2 000的marker;泳道1:阴性对照;泳道2,3:西瓜炭疽菌扩增结果;泳道4,5:菜豆炭疽菌扩增结果;泳道6~22分别是:尖孢炭疽菌、辣椒刺盘孢菌、果腐刺盘孢菌、毁灭炭疽菌、胶孢炭疽菌、白菜炭疽菌、香蕉炭疽菌、平头刺盘孢菌、番茄早疫病菌、葡萄灰霉病菌、板栗疫病菌、西瓜枯萎病菌、苹果轮纹病菌、大豆疫霉病菌、大雄疫霉菌、立枯丝核菌、棉花枯萎病菌

M: DL2 000 marker; Lane 1: Negative control; Lane 2, 3: C. orbiculare isolates; Lane 4, 5: C. lindemuthianum isolates; Lane 6﹣22: C.acutatum, C.capsici, C.coccodes, C.destructivum, C.gloeosporioides, C.higgisianum, C. musae, C.truncatum, Alternaria solani, Botrytis cinerea, Cryphonectria parasitica, Fusarium oxysporum, Macrophoma kawatsukai, Phytophthora sojae, Phytophthora medicaginis, Rhizoctonia solani and Verticillium dahliae


图1 引物CY1/CY2 PCR扩增电泳图

Fig. 1 Specific amplification with CY1/CY2 primers




M:DL2 000的marker;泳道1~11:西瓜炭疽菌扩增结果;泳道12~16:菜豆炭疽菌扩增结果

M:DL2 000 marker;Lane 1﹣11:C. orbiculare isolates;Lane 12﹣16:C. lindemuthianum isolates

图2 S1091对西瓜炭疽菌和菜豆炭疽菌扩增图

Fig. 2 DNA amplification with RAPD primer S1091



M:DL2 000的marker;泳道1:阴性对照;泳道2~13:西瓜炭疽菌扩增结果;泳道14~18:菜豆炭疽菌扩增结果

M:DL2 000 marker;Lane 1:Negative control;Lane 2﹣13:C. orbiculare isolates;Lane 14﹣18:C. lindemuthianum isolates


图3 RB/RC对西瓜炭疽菌和菜豆炭疽菌的扩增图

Fig. 3 Specific amplification with RB/RC primers




利用CY1/CY2,RB/RC引物组成的双重PCR反应体系,在C. orbiculare上能扩增出442 bp和216 bp的条带,C. lindemuthianum只能扩增出442 bp的条带,其它相关和近似菌株及空白对照均无扩增条带,因此,双重PCR反应体系能对西瓜炭疽菌进行特异性检测(图4)。



M:DL2 000的marker;泳道1:阴性对照;泳道2~13:西瓜炭疽菌扩增结果;泳道14~18:菜豆炭疽菌扩增结果

M:DL2 000 marker;Lane 1:Negative control;Lane 2﹣13:C. orbiculare isolates;14﹣18:C. lindemuthianum isolates


图4 CY1/CY2、RB/RC对西瓜、菜豆炭疽菌的扩增

Fig. 4 Specific amplification with CY1/CY2 and RB/RC primers



2.5 引物灵敏度的测定

C. orbiculare基因组DNA从10 ng·μl-1开始依次10倍稀释至100 ag·μl-1,各浓度取1 μl为模板进行扩增。结果表明在25 μl的反应体系中,引物CY1/CY2、RB/RC以及由二者组成的双重反应体系能检测到1 pg·μl-1的DNA(图5)。



a、b、c分别是引物CY1/CY2、RB/RC以及CY1/CY2和RB/RC组成的双重体系扩增不同浓度基因组DNA的灵敏度检测电泳图

M:DL2 000的marker;泳道1:阴性对照;泳道2~10分别是在25 μl的体系中含有10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag DNA量的扩增结果

a, b, c, the sensitivity of PCR using different concentration of DNA with primers CY1/CY2, RB/RC, CY1/CY2 and RB/RC, respectively

M: DL2000 marker; Lane 1: Negative control; Lane 2﹣10: Genomic DNA of 10ng, 1ng, 100pg, 10pg, 1pg, 100fg, 10fg, 1fg, 100ag respectively


图5 引物灵敏度检测电泳图

Fig. 5 Sensitivity detection of C. orbiculare with two couples of primers


2.6 发病植株组织中病菌的快速检测

按照2.4中的方法从发病的西瓜果皮、西瓜叶片以及健康的西瓜组织上快速提取DNA,以西瓜炭疽菌基因组DNA为阳性对照,用双重PCR进行检测。结果显示,在发病的西瓜组织上提取的DNA能扩增出442 bp和216 bp的条带,而健康的西瓜及叶片上没有产生条带(图6)。

3 讨论

核糖体转录间隔区(ITS),是介于18 S rDNA、5.8 S rDNA和28 S rDNA之间的区域,该区域进化速率较编码区快,在种内不同菌株间高度保守,而在真菌的种间存在着丰富的变化,可以为研究真菌的系统发育、分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息。以




M:DL2 000的marker;泳道1:阴性对照;泳道2:阳性对照;泳道3:发病西瓜果皮提取DNA扩增结果;泳道4:发病西瓜叶片提取DNA扩增结果;泳道5:健康西瓜提取DNA扩增结果;泳道6:健康西瓜叶片提取DNA扩增结果

M: DL2 000 marker; Lane 1: Negative control; Lane 2: Positive control; Lane 3: Infected fruits; Lane 4: Infected leaves; Lane 5: Pathogen-free fruits; Lane 6: Pathogen-free leaves


图6 西瓜发病组织检测

Fig. 6 Specific amplification by duplex PCR from waterme lon tissues infected by C. orbiculare


ITS序列为基础,Frederick等[13]、Trout等[14]、Bontans等[15]、Grote等[16]分别成功开发出大豆层锈菌、马铃薯晚疫病菌、草莓疫霉、烟草疫霉等的分子检测引物。Zhang等[17]利用ITS序列,设计出西瓜枯萎、西瓜蔓枯病菌的引物;谢勇等[18]设计出了烟草疫霉的特异引物,并在不同病组织、病土中对烟草黑胫病菌进行了分子检测;王立安等[19]通过ITS序列比较,建立了大豆疫霉分子检测体系。

SCAR(sequence-characterized amplified regions)标记是在RAPD技术上发展起来的方法,它根据筛选到的特异的RAPD片段的序列设计引物,再进行PCR扩增,从而可以将与原RAPD片段相对应的单一位点SCAR鉴定出来,具有比RAPD更高的稳定性。正是由于SCAR标记的稳定性和可靠性,越来越多的学者将此方法用于植物病原物的检测和鉴定中。Radisek 等[20]、Hermosa等[21]、Hendrika等[22]分别利用SCAR标记对Verticillium alboatrumTrichoderma atroviride以及Meloidogyne spp.进行了检测。

目前,Colletotrichum属的研究,主要集中在就C. gloeosporioidesC.fragariaeC. coccodesC. acutatum等几个种的鉴定方面,多以ITS序列[4~6]、RFLP分析[9]、同工酶分析[10]等为基础开展工作。对Colletotrichum orbiculare的分子鉴定和检测研究还未见报道。

在本研究中,笔者发现仅用ITS做为靶序列,并不能把C. orbiculareC. lindemuthianum分开,两者在序列上仅相差7个碱基,无法通过设计引物将两者分开。Martinez-Culebras[6]也报道由于C.fragariaeC.gloeosporioides在ITS序列上同源性高,无法利用ITS序列来设计C.fragariae的特异性引物。因此,笔者通过RAPD转SCAR标记再设计1对引物,利用双重PCR体系对C. orbiculare进行检测,获得了很好的结果。张竞宇等[23]在对Tilletia indica的检测中发现,由于Tilletia indicaTilletia walkeri的ITS序列只相差1个碱基,也无法直接做到对Tilletia indica的检测,只能再根据二者线粒体DNA的差异设计特异性引物。所以,在对某些病原菌的分子检测和鉴定中,如果仅根据ITS序列做为靶目标设计引物,有可能无法将其与同属中的其它种分开,容易在检测过程中产生假阳性。

本研究利用常规PCR为西瓜和甜瓜炭疽病提供了准确的鉴定和快速的检测手段。虽然检测灵敏度可以达到1 pg·μl-1的DNA,但仍然不能精确的定量测定。我们将进一步采用实时荧光定量PCR技术,利用荧光监测系统对扩增过程进行实时监控,精确的检测出病菌含量情况,这对控制西甜瓜病害的发生和采后的腐烂变质会具有更大的意义。

4 结论


利用ITS序列分析及RAPD转SCAR标记,设计出两对引物CY1/CY2、RB/RC,建立的双重PCR反应检测体系可以从供试的147个菌株中将C. orbiculare特异检测出来,检测灵敏度达到1 pg·μl-1,符合田间诊断的要求。
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(责任编辑 王红艳)


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收稿日期:2005-11-11;接受日期:2006-08-17

基金项目:上海市重大科技攻关项目(03DZ19316)和上海市科技兴农重点攻关项目(农科攻字2002[第3-1-2号])资助

作者简介:唐建辉(1980-),男,江西高安人,硕士研究生,研究方向为分子植物病理学,E-mail: huijiant@163.com。通讯作者王 伟(1963-),黑龙江双城人,教授,博士,研究方向为植物病理学。Tel:021-64253707;E-mail: weiwang@ecust.edu.cn






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